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저온생물학에서 동결보존이란 세포나 조직, 기관, 개체를 저온에서 장기간 보관해 가능한 한 원형을 유지하고자 하는 것을 말한다. 물론 이렇게 동결보존하는 목적은 이를 다시 해동해서 냉동 이전의 상태로 되돌리려는 것이다. 지금까지의 기술로 냉동보존이 가장 흔하게 이뤄지고 있는 대상은 하나의 세포다. 정자나 난자, 수정란 등이 대표적 예다. 세포 수준의 냉동보존은 어떻게 이뤄지는지 살펴보자.

핵심은 물의 처리

동결보존의 핵심 과정은 세포 내에서 약 90%를 차지하는 물의 처리다. 물은 동결과정에서 날카로운 얼음결정을 형성한다. 이 얼음결정은 세포막이나 세포 소기관에 상처를 입혀 해동 후 세포들이 제기능을 발휘하지 못하게 하는 주요 원인이 된다. 얼음결정의 형성을 피하기 위해서 많은 연구자들은 세포 내의 물을 제거하는 여러가지 방법을 고안했다. 대표적인 것이 ‘동결억제제’(CPA, CryoProtective Agent)를 이용해 세포질 내의 물을 치환시켜 빼내는 방법이다.

동결억제제에는 일반적으로 글리세롤과 DMSO(DeMethyl SulfOxide), PR-OH(PROpHandiol), EG(Ethylene Glycerol) 등이 많이 쓰인다. 동결억제제를 생리식염수에 섞은 뒤 여기에 세포를 담그면 세포질 내의 물이 세포 밖으로 빠져나오고, 그 자리에 동결억제제가 들어간다. 삼투압의 원리 때문에 가능한 일이다.

삼투압은 농도가 다른 두 물질을 섞었을 때 고농도와 저농도 물질 사이에 농도 평형이 이뤄지는 현상이다. 소금물에 배추를 절이는 원리가 바로 삼투압을 이용한 것이다. 고농도의 동결억제제가 담긴 용액에 세포를 담그면 세포 밖의 농도는 세포 안보다 높은, 즉 세포 안팎에 농도 불균형이 생긴다. 이때 세포질 내의 물은 세포 안팎의 농도평형을 맞추기 위해 세포질 밖으로 나오고, 세포 밖의 동결억제제는 세포 안으로 들어간다. 이런 작용은 세포 안팎의 농도가 평형을 이룰 때까지 계속된다.

이 방법은 세포질 내 1/3 정도의 물이 동결억제제와 치환될 때까지 계속된다. 물론 계속해서 고농도의 동결억제제를 사용하면 세포질 내의 물을 모두 빼낼 수 있겠지만, 이럴 경우 세포는 치명적인 손상을 입는다. 동결억제제는 주로 유기물질이며 알코올 성분을 함유하고 있어 자체적으로 강한 독성을 갖고 있기 때문이다. 만약 고농도의 동결억제제에 세포가 계속해서 노출된다면, 세포막이나 세포 내 여러 소기관들은 회복할 수 없는 손상을 입게 된다. 따라서 물을 치환하는 과정은 세포를 저농도에서 고농도의 동결억제제로 옮겨가며 순차적으로 매우 조심스럽게 진행된다. 어느 정도 농도에 얼마동안 담그느냐에 따라 세포의 동결보존 성공여부가 결정된다고 해도 과언이 아니다. 따라서 물을 동결억제제와 치환하는 과정이 세포 동결보존의 핵심 기술이다.

냉동된 세포를 해동할 때는 냉동과정과는 반대의 순서를 거친다. 즉 고농도에서 저농도의 동결억제제로 옮겨가며 세포내의 동결억제제를 물과 서서히 치환한다.

느리거나 혹은 아주 빠르거나

이렇게 일부 또는 상당 부분의 물이 제거된 세포는 액체질소와 같은 냉매를 이용해 온도를 떨어뜨려 동결하게 된다. 이 과정에는 대표적으로 ‘완만동결법’(slow cooling method)과 초급속동결법인 ‘유리화동결법’(vitrification)이 사용되고 있다. 핵심은 일부 남은 물이 얼음결정을 이루지 않고 냉각되도록 온도를 아주 천천히 또는 급속하게 떨어뜨리는데 있다.

완만동결법은 과거 수십년 전부터 널리 사용되고 있는 방법으로, 오늘날에도 가장 많이 쓰이고 있다. 완만동결법은 냉동기(freezer)라 불리는 기계 내의 컴퓨터가 자동으로 액체질소의 공급량을 조절해 냉동속도를 자동으로 조절할 수 있다. 즉 이름처럼 얼음결정이 최대한 생기지 않도록 세포의 동결온도를 천천히 내리는 방법이다. 완만동결법은 그동안 여러 과학자의 수많은 연구에 의해 효율적인 절차나 안정성이 입증돼 있다는 장점이 있지만, 장비의 가격이 비싸고 동결된 세포를 유지·관리하기 까다롭다는 단점이 있다.

이에 비해 유리화동결법은 최근에서야 주목받고 있는 방법이다. 이론적 배경은 약 1백년 전 유럽의 학자에 의해 제시된 바 있지만, 그동안 효율적인 절차와 성공사례가 보고된 적이 없어 널리 쓰이지 않고 있었다.

유리화동결법의 기본 원리는 고농도의 동결억제제를 이용해 세포 내 물을 상당부분 제거하고, 이를 액체질소에 바로 담그는 초급속냉동법이다. 이름에서 ‘유리화’는 동결과정 중 세포 내 수분과 동결억제제가 결정이 만들어지지 않는 유리처럼 된다고 해서 붙여진 이름이다. 즉 이 방법으로는 얼음결정이 형성되지 않는다는 말이다. 초기에는 이 같은 이유 때문에 동결방법의 획기적 개선으로 받아들여졌지만, 고농도의 동결억제제를 사용한다는 점이 문제였다. 고농도의 동결억제제는 세포에 치명적 피해를 입힌다. 심하게 말해 얼음결정을 막아보겠다고 세포를 ‘너덜너덜’하게 만드는 방법인 것이다.

하지만 1985년 랄과 패이 박사는 유리화동결법의 새로운 가능성을 열었다. 이들은 동결억제제의 농도와 처리시간을 조절해 독성을 줄이고 생존율을 높이는 방법을 개발했다. 수많은 실험 끝에 얻어낸 그들의 절차는 이후 여러 과학자들의 노력으로 점차 안정된 방법으로 자리잡고 있다. 랄과 패이 방법의 기본 원리는 고농도의 동결억제제에 담그는 시간을 최대한 줄이고 담그는 과정 자체를 저온에서 실시한다는 것이다. 이렇게 하면 세포의 손상을 최소한으로 줄일 수 있다는 점이 실험적으로 입증됐다.

랄과 패이 이후 유리화동결법은 널리 사용되고 있다. 특히 동결과정에서 얼음결정이 형성되지 않고 그 과정이 비교적 단순하다는 장점 때문에 많은 주목을 받고 있다.

대충 얼려도 살아남는 정자

세포 수준의 동결보존 대상 중에서 가장 먼저, 그리고 가장 널리 쓰이고 있는 것은 정자다. 정자의 동결보전은 과거 2백년 전부터 시행됐다. 의학적 목적뿐 아니라 축산업 등 산업적으로도 응용가능성이 많기 때문이다.

정자의 동결보존에는 일반적으로 완만동결법 또는 이를 약간 변형한 방법을 사용하고 있다. 채취된 정액을 동결억제제로 처리한 뒤 초저온에서도 견딜 수 있는 용기에 담아 서서히 냉동시켜 얼린 다음 극저온의 냉동기에 보관하는 것이다. 정자의 냉동은 여성이 불규칙적인 생리 주기를 갖고 있어 수정시기를 맞추기 어려운 경우나, 정자 수가 적은 남성이 여러번의 동결보존을 통해 적정수의 정자 수를 확보할 필요할 있는 경우, 그리고 수술이나 항암제 투여 등으로 수정능력의 보존이 필요한 경우 등에 사용되고 있다.

정자의 냉동보존이 널리 쓰이고 있는 이유는 다양한 응용가능성 이외에도 동결정자의 높은 생존율 때문이다. 정자는 다른 세포에 비해 세포질 내에 존재하는 소기관의 수가 적다. 정자는 탄생 목적에 맞게 전달할 유전자(핵)와 이를 전달하는데 필요한 필수 세포질만 갖고 나머지 소기관들은 모두 버린다. 즉 다른 세포에 비해 세포질 양과 수분이 적어 얼음결정의 피해로부터 어느 정도 자유로운 것이다.

또한 정자는 냉동에 강한 구조적 특성을 갖고 있다. 보통 세포의 염색체는 기다란 이중나선이 새끼줄처럼 복잡하게 꼬여 동그랗게 뭉쳐있다. 이때 염색체가 서로 얽히는 것을 방지하고 ‘압축’의 능률을 높이기 위해 ‘히스톤’이라는 단백질이 존재한다. 히스톤 단백질은 염색체가 휘감을 수 있는 일종의 지지대 역할을 하는 것이다.

하지만 정자에는 히스톤 대신 ‘프로타민’이라는 단백질이 들어 있다. 프로타민 단백질은 히스톤보다 안정된 구조를 갖고 있고 특히 열에 강하다. 즉 냉동시켜도 얼음결정의 공격에 비교적 강한 특성을 보이는 것이다. 정자가 이런 구조를 갖게된 데는 후손을 더 많이 남기려는 진화의 결과이겠지만, 냉동학자의 입장에서는 여간 기특한 구조가 아닐 수 없다. 조금 과장해서 말하면 정자는 ‘대충’ 얼린 다음 해동해도 다시 살아날 수 있는 구조를 갖고 있는 것이다. 정자의 냉동 후 생존율은 적어도 50%, 최고 90%이다.

금속채로 건져낸 난자

정자가 냉동보존된다면 난자는 어떨까. 결론부터 말하면 난자도 된다. 다만 정자보다는 냉동과정이 훨씬 까다롭고 이에 따라 생존율도 낮을 뿐이다. 난자는 일단 크기가 일반 체세포나 정자에 비해 크다. 포유류의 난자는 약 1백20-1백50μm(마이크로미터, 1μm=${10}^{-6}$m) 정도로 보통 세포의 약 5만배 이상이다. 이는 난자가 육안으로 보인다는 점에서도 어느 정도 짐작할 수 있다.

따라서 난자는 세포 내 많은 물을 갖고 있고, 특히 성숙한 난자의 경우 핵막이 없어 세포질 내에 염색체들이 둥둥 떠다닌다. 이는 얼음결정에 의한 유전자 피해도 커짐을 의미한다. 또한 난자의 세포질에는 일반 세포의 분열시기에만 볼 수 있는 특수기구들이 상존하는데, 이로 인해 냉동보존이 더욱 힘들어진다. 난자의 세포질에는 마이크로튜블로 구성된 방추체라는 염색체 분열기구가 있다. 이들은 정자와 수정 후 세포분열을 할 때 꼭 필요한 기구들이다.

방추체로부터 나온 마이크로튜블은 세포질 내에 둥둥 떠다니는 염색체에 연결돼 염색체를 일렬로 정렬시키는 역할을 한다. 그런데 바로 이 마이크로튜블이 문제다. 긴 막대기 모양으로 생긴 마이크로튜블은 냉동과정에서 너무 쉽게 손상을 입는다. 이들이 손상되면 정상적인 세포분열이 이뤄지지 않기 때문에 냉동과정에서 반드시 보호해야 한다. 하지만 이 과정이 몹시 까다롭다.

이런 이유들로 인해 그동안 난자의 냉동보존은 어렵다고 알려져 왔다. 하지만 1986년 첸 박사가 완만동결법을 이용해 난자를 동결보존한 후 시험관아기 시술을 통해 아기를 탄생시키는데 최초로 성공했다. 하지만 그 성공률은 아주 미미했고, 최근까지도 많은 연구에도 불구하고 저조한 성공률을 보이고 있다.

하지만 1990년대 후반 동물의 난자를 대상으로 초급속동결법인 유리화동결법이 도입되기 시작했고, 이 방법을 통해 좋은 결과들이 속속 발표되고 있다.

약한 구조 보강하고 동결액은 줄인다

포천중문의대 차병원의 차광열 교수와 윤태기 교수팀은 ‘그리드’(GRID)라는 특수한 방법을 도입했다. 그리드는 열전도율이 좋은 전자현미경용 금속망이다. 이들은 일종의 채처럼 생긴 그리드를 난자가 담긴 배양액에 넣고 난자를 건져올리는 방식을 고안해냈다. 그러면 채 위에 난자만 붙고 배양액과 동결방지액은 채 밑으로 흘러내린다. 난자만 건져낸 그리드를 액체질소에 넣어 급속도로 냉각시키면 기존의 방법보다 좋은 결과를 얻을 수 있다. 즉 동결액의 양을 최소로 줄이고 동결속도를 더욱 빠르게 하는 것이 생존율에 좋은 영향을 준다는 사실을 알아낸 것이다.

미국불임학회의 학술잡지인 ‘수정과 불임’(Fertility and Sterility) 2003년 6월호에는 냉동난자에 관한 차병원의 최신연구가 게재됐다. 연구팀은 시험관아기 시술 환자로부터 회수한 성숙난자 중 시험관아기 시술에 사용하고 남은 잉여난자를 환자의 동의를 얻어 유리화동결법으로 냉동난자를 동결보존했고, 이를 해동해 수정란의 생산과 임신 및 건강한 아이의 출산에 성공했다.

논문에 따르면 시험관아기 시술 환자 34명에게서 얻은 냉동난자 4백74개를 해동한 결과, 3백25개(68.8%)의 난자가 형태적으로는 이상이 없는 난자로 판명됐고, 이 중 1백98개(61%)의 난자가 정상적인 세포질을 가진 것으로 판명됐다. 이 기능적으로 정상적인 난자를 대상으로 세포질 내에 정자를 직접 주입하는 방식으로 수정을 시도했다. 그 결과 난자의 수정률은 71.7%(1백42/1백98)였다. 이 배아를 총 28명의 환자에게 이식했더니 모두 6명이 임신에 성공해 모든 산모가 건강한 아이를 분만했다.

이처럼 현재는 난자의 냉동보존을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근에는 필자를 포함한 많은 연구자들이 난자동결보존의 효율을 높이고자 새로운 과학기술을 도입하고 있다. 대표적 예가 택솔이다.

택솔은 난자 내 염색체 분열기구의 안정성을 높이기 위해 첨가하는데, 동결방지액과 함께 난자 세포질로 들어간 택솔은 마이크로튜블에 결합해 강도를 높이는 것으로 알려졌다. 만약 택솔이 제대로 작용한다면 마이크로튜블은 얼음결정의 공격에도 어느 정도 버틸 수 있을 것이다. 실제로 필자의 연구진이 이 방법을 생쥐의 난자에 적용한 결과, 이전보다 좀더 높은 생존율을 나타냈다.

또한 많은 동결 연구팀은 기존의 스트로보다 얇은 스트로에 난자를 넣는 방법과 냉동루프를 이용하는 방법을 선보이고 있다. 냉동난자의 성공조건 중 하나는 냉동시 동결액의 양인데, 두가지 방법 모두 동결액의 양을 최소한으로 줄이기 위해 고안된 방법이다. 난자 하나만 들어갈 정도의 얇은 스트로에 난자를 넣고 냉동시키면, 난자 주변에 동결액이 남아 있을 확률이 그만큼 줄어들 것이다. 또한 냉동루프는 비눗방울을 만들 때처럼 동그란 루프를 이용해 동결액에서 난자를 건지는 방식이다. 루프에 형성된 동결액 막에 난자 하나가 걸린다면 막 두께만큼의 동결액만 난자 주위에 남을 것이다. 이런 루프를 바로 급속냉동시키면 동결액의 양을 최소화할 수 있다는 아이디어다.

정자나 난자 이외에도 배아(수정란)를 냉동시킬 수 있다. 배아는 난자에 비해 동결과정에 덜 민감한 것으로 알려져 있고, 따라서 좀더 초기에 방법이 정립돼 현재 널리 사용되고 있다.

자연임신보다 높은 확률?

특히 최근에는 배란을 유도하는 약물이 발전해 한번에 채취할 수 있는 난자 수가 늘어나고 있고, 수정 및 배양기술의 발달로 잉여배아 수가 점점 늘고 있다. 특히 냉동배아는 시험관아기 수술 후 남는 잉여배아의 처리 문제로 반드시 필요한 기술이기 때문에 많은 연구가 이뤄지고 있다.

배아의 동결보존 생존율은 시술기관에 따라 차이가 있지만 대략 60-80% 정도이고, 냉동배아의 이식후 임신 성공률은 30-40% 정도로 보고되고 있다. 이 수치는 일반적으로 동결하지 않은 배아에 비해 약 10% 정도 낮은 것이다. 하지만 최근 동결기술의 발전과 배아 이식을 받는 환자의 자궁내막을 임신에 적절하도록 조절하는 기술이 발전함에 따라 냉동배아의 임신 성공률은 자연임신과 비슷하거나 오히려 더 높다는 보고도 나오고 있다.

한편 냉동배아는 사회적인 문제도 야기하고 있다. 우선 냉동배아의 처리 문제다. 냉동배아는 주로 시험관아기 시술 후 남는 잉여배아에 대해 이뤄지고 있다. 시험관아기를 한번 시술할 때 평균 10개 정도의 배아가 만들어진다. 이들 중 서너 배아만 자궁에 이식한 후 나머지는 모두 냉동배아로 만든다. 우리나라의 경우 가임여성의 15%가 불임이라고 알려져 있다. 이들 중 많은 수가 시험관아기 시술을 시도하는데, 1년에 생산되는 냉동배아의 수는 수만에 이를 것으로 추정된다.

냉동배아는 모두 환자의 동의를 거쳐 만들지만, 쓰고 남은 냉동배아의 처리는 여간 골치거리가 아니다. 다른 의학적출물처럼 폐기하거나 버릴 수도 없고, 환자가 이사 등으로 인해 연락이 두절될 경우는 특히 문제다. 현재는 시험관아기 시술병원의 냉동시설에 모두 저장돼 있으나 동결보존의 역사가 20년이 넘어가면서 냉동배아의 보관연도 제한이나 폐기에 관한 문제가 제기되고 있는 실정이다.

냉동배아의 이런 문제는 자연스럽게 생명윤리 논쟁과도 직결된다. 독일의 경우 배아를 생명체로 인정하기 때문에 동결보존이 금지돼 있다. 하지만 미국이나 일본 등지에서는 냉동배아가 허용돼 있고, 우리나라는 냉동배아를 규제할만한 마땅한 법률이 아직 마련돼 있지 않다. 냉동배아의 이용과 보관에관한 사회적 합의를 서둘러야 할 때이다.